Ізоферментів (ізозімов)
Коли ми говоримо «малатдегідрогеназа» або «глюкозо-6-фосфатаза», то зазвичай маємо на увазі конкретний білок, що володіє форментатівной активністю, проте в дійсності ці найменування охоплюють всі білки, що каталізують окислення малата в оксалоацетат або гідроліз глюкозо-6-фосфату з утворенням глюкози і. Зокрема, після виділення малатдегідрогенази з різних джерел (печінки щура, Е. coli) виявилося, що ферменти з печінки і фермент з Е. coli, що каталізують одну і ту ж реакцію, розрізняються в багатьох відносинах за своїми фізичними і хімічними властивостями. Фізично помітні форми ферментів, що володіють одним і тим же видом каталітичної активності, можуть бути присутніми в різних тканинах одного організму, в різних типах клітин однієї тканини і навіть в прокаріотів, наприклад в Е. coli. Це відкриття було зроблено завдяки застосуванню електрофоретичних методів розділення білків, в результаті чого були виявлені електрофоретичної різні форми певної ферментативної активності.
Діагностичне значення ізозімов
Ізозімов сироваткової лактатдегідрогенази виявляються після електрофорезу при на крохмальної, агаровом або поліакриламідному гелях. При зазначеному значенні ізозімов несуть різний заряд і розподіляються на електрофореграмме в п'яти різних місцях. Далі ізозімов можна виявити завдяки їх здатності каталізувати відновлення безбарвних барвників в нерозчинну забарвлену форму.
Типовий набір реагентів для виявлення ізозімов дегідрогенази включає:
1) відновлений субстрат (наприклад, лактат);
3) барвник в окисленої формі (наприклад, блакитна нітротетразоліевая сіль);
4) переносник електронів від NADH до барвнику [наприклад, феназінметасульфат (ФМС)];
5) буфер; активують іони (якщо потрібні).
Лактатдегидрогеназа каталізує перенесення двох електронів і одного іона від лактату до
Мал. 7.8. Реакція, що каталізується -лактатдегідрогеназой.
(Рис. 7.8). Якщо електрофореграмме обприскати наведеної вище сумішшю і потім інкубувати при то реакція сполученого перенесення електронів буде протікати тільки в тих місцях, де присутня лактатдегідрогенази (рис. 7.9). Відносну щільність забарвлення смуг можна далі оцінити кількісно за допомогою скануючого фотометра (рис. 7.10). Ізозім з найбільшим негативним зарядом позначають.
Фізична природа ізозімов
Олігомерні ферменти, утворені різними протомеров, можуть бути представлені декількома формами. Часто певна тканина продукує переважно один з протомеров. Якщо активний олігомерного фермент (наприклад, тетрамер) може бути побудований з таких протомеров в різних комбінаціях, то утворюються ізозімов.
Ізозімов лактатдегідрогенази розрізняються на рівні четвертинної структури. Олігомерного молекула лактатдегідрогенази (мол. Маса 130000) складається з чотирьох протомеров двох типів, Н і М (обидва з мовляв. Масою близько 34000). Каталітичної активністю володіє тільки тетрамерная молекула.
Мал. 7.9. Локалізація лактатдегідрогенази на електрофореграммс з використанням системи сполучених реакцій.
Якщо порядок з'єднання протомеров не має значення, то протомери можуть бути скомпоновані п'ятьма способами:
Маркерт підібрав умови для руйнування і реконструкції четвертичной структури і зумів з'ясувати взаємини між ізозімов лактатдегідрогенази. Розщеплення і реконструкція лактат-дегідрогеназ I, і 15 не призводять до утворення нових ізозімов. Отже, ці два ізозімов містять тільки один тип протомеров. Коли такою ж процедурою була піддана суміш Лактатдегідрогеназа 1, і 15, з'явилися також форми 12, 13 і 14. Співвідношення ізозімов відповідає наведеному нижче субодиничних складу:
Синтез Н і М-субодиниць детермінується різними генетичними локусами, і вони по-різному експресуються в різних тканинах (наприклад, в серцевої і скелетної м'язах).