Клонування методом стрибків. Створення та скринінг бібліотек генів.
Метод клонування способом «стрибків по хромосомі» дозволяє ідентифікувати ділянки, віддалені один від одного на сотні тисяч нуклеотидів, не виділяючи проміжну послідовність. Для створення бібліотеки генів методом «стрибків по хромосомі» проводять рестрикцию геномної ДНК редкощепящей рестриктазой (як правило, найбільш зручний фермент, сайти рестрикції якого знаходяться на відстані приблизно 200 т.п.н.-довжина стрибка). Ці фрагменти зшивають з невеликим маркерним геном, як правило з геном supF (довжина = 7 т.п.н.) фага X, що призводить до циклізації фрагмента. В результаті цього кінцеві ділянки, початково що знаходилися на відстані кількасот т.п.н. віддалені один від одного лише на довжину маркерного гена. Обробивши кільцеві молекули среднещепящей рестриктазой (найбільш часто використовують EcoR1), відбирають фрагменти довжиною приблизно 20 т.п.н. серед яких і містять маркерний ген і фланкирующие його послідовності. При встановленні в вектор ампліфікувати в клітинах-господарях негативних по маркерні гену будуть тільки послідовності, що містять цей ген.
Далі ідентифікують клон методом гібридизації з ДНК-зондом. специфічним для вихідної послідовності. При подальшому субклонірованіі в плазмідної вектора отримують два субклона. Один субклон гибрідизуючою з ДНК-зондом, специфічним для вихідної послідовності, другий - не гибрідизуючою з цим ДНК-зондом і містить фрагмент ДНК, віддалений від початку вихідної молекули на довжину стрибка.
Після створення геномних бібліотек. містять великі фрагменти ДНК, і побудови карт контіг методи «прогулянки» і «стрибків по хромосомі» втратили свою актуальність.
Бібліотеки генів і їх скринінг. На основі технології клонування, що дозволяє виявляти певний фрагмент ДНК і отримувати його в необхідній кількості, сконструйовані бібліотеки генів, що служать джерелом різних фрагментів ДНК. Бібліотека генів - це повний набір клонованих перекриваються ДНК-фрагментів, які отримані в результаті рестрикції або механічного розрізання вихідної молекули ДНК, виділеної з будь-якого біологічного матеріалу (тканин, культур клітин, окремої хромосоми або з її фрагментів). Кількість різних клонів, або інформаційна ємність бібліотеки, залежить від розміру вихідної ДНК (геному) і обов'язковості присутності кожного фрагмента хоча б в одному клоні. Оптимальний розмір перекриваються фрагментів для клонування при створенні бібліотеки генів повинен відповідати середньому розміру гена того виду або типу живих організмів (для ссавців - 15-25 т.п.н.), для якого вона створюється.
Бібліотека може містити всю геномної ДНК даного виду (екзонів, інтрони і міжгенних ділянки) або тільки що кодують послідовності.
Бібліотеки. створені на основі тотальної геномної ДНК і включають Екзони, інтрони і міжгенних ділянки називають геномними. Інформаційна ємність геномних бібліотек ссавців становить не менше 8 * 105-106. Фрагменти оптимального розміру з геномної ДНК людини отримують при рестрикції частощепящімірестріктазамі Say 3A або Mbol.
Бібліотеки кДНК складаються тільки з екзонів. Їх конструюють з кДНК, отриманої за допомогою зворотної транскрипції мРНК, яка виділена з біологічного матеріалу, експресує досліджувані гени. Розрізняють бібліотеки екс-прессірующіхся кДНК і селективних кДНК.
Отримавши ДНК / кДНК. її розрізають на фрагменти, довжина яких залежить від обраного клонуючого вектора, і конструюють векторну систему, Залежно від обраного для клонування вектора розрізняють YAC-, ВАС (bacterial artificial chromosomes) - і РАС (plasmid artificial chromosomes) -бібліотеки, що містять великі фрагменти ДНК людини. Фагові і космідние бібліотеки генів найбільш зручні для зберігання великих кількостей химерних ДНК. Для створення бібліотек генів в основному використовують фагів, космідние і YAC-системи. YAC-бібліотеки генів є фрагментами геномної ДНК людини розміром до 1 млн п, н. «Зшиті» з центромерного районами хромосом дріжджів. Після ідентифікації необхідного клону YAC-бібліотеки уставний ділянку може бути субклонірован в фагових або космідних бібліотеках. Найбільш зручно бібліотеки генів людини конструювати, використовуючи клонуючі вектори на основі фага X - EMBL3 і EMBL4. Це обумовлено характеристиками векторів: інтервалом пакующей здатності - 9-23 т.п.н .; наявністю великої кількості зручних клонують сайтів (що дозволяє використовувати різні рестріктази при отриманні фрагментів ДНК для инсерции); відсутністю послідовностей плазмід pBR322 і ColE1, найбільш часто використовуваних для клонування (що дозволяє проводити відбір потрібних клонів за допомогою фагової ДНК, що не вирізаючи вставку).
Скрініруя бібліотеки генів. здійснюють пошук потрібних послідовностей ДНК Вибір методу скринінгу залежить від специфічних особливостей цих послідовностей. Для скринінгу бібліотек, як правило, використовують блот-гібридизацію з ДНК-зондами (олігонуклеотидних, до ДНК і іншими) або іммунноблот зі специфічними антитілами (якщо бібліотека сконструйована на основі експреccірующего вектора). Скринінг включає кілька последовательньгх етапів: висівання химерних фагів бібліотеки на газон бактерій, що ростуть на поверхні твердої живильного середовища в чашках Петрі (кожна литическая бляшка на бактеріальному газоні - результат інфікування клітин одним клоном фага); «Передрук» отриманих культур на інші чашки Петрі з метою їх дублювання; перенесення зростаючих і лу вихідних колоній на фільтр з одночасним руйнуванням клітинних мембран, фіксуванням білків і ДНК; блот-гібридизація з міченим ДНК-зондом або імуноблот з міченими антитілами (для експресійних бібліотек). Заключний етап скринінгу включає виявлення позитивних колоній фагів методом радиоавтографии (після видалення незв'язаних ДНК-зондів і антитіл темні плями на рентгенівській плівці виявляться в місцях локалізації колоній, що містять комплементарний зонду фрагмент ДНК, або специфічний антиген) і їх відбір на дубльованих культурах. З метою уникнення помилок проводять неодноразовий скринінг відібраних колоній.
Далі для отримання достатньої кількості відібраного фрагмента з метою його дослідження або використання в якості ДНК-зонда його субклоніруют в плазмідної вектора.