Культивування мікроорганізмів це один з основних прийомів в мікробіології. Для росту і розвитку мікроорганізмів в природі і в лабораторних умовах необхідна наявність поживних речовин для енергетичних і конструктивних реакцій. Вимоги різних груп мікроорганізмів до джерел енергії і хімічних елементів визначаються їх метаболічними можливостями. Вирощування і підтримання мікробних культур в лабораторії засноване на моделюванні природних умов проживання даного організму в лабораторії, а також на знанні особливостей обміну речовин.
Культивування є основною стадією технологічного процесу і багато в чому визначає кількісні та якісні ха-рактеристики виробництва біопрепаратів. На стадії культивування здійснюється накопичення як самої біомаси, так і продуктів метаболізму (життєдіяльності) мікро-організмів.
Початком досліджень по культивуванню мікроорганізмів є 1830 рік, коли Каньяр де Латур, Кютцінг і Шван встановили, що у багатьох бродильних процесах «винні» зростання і розмноження дріжджів та інших мікроорганізмів. Лібіх і багато інших хіміки були противниками такої думки, що загальмувало ці дослідження на 20 років. У 1850 році Луї Пастер, досліджуючи фізіологію дріжджів і бактерій, ввів асептичні методи досліджень і на мінімальних живильних середовищах довів, що спіртово-, молочно, уксусно- і маслянокислое бродіння викликаються різними мікроорганізмами, що володіють різними потребами в поживних речовинах і кисні.
Перша найбільш повноцінна сфера була приготовлена учнем Л. Пастера Роленомв 1869 році для грибів роду Aspergillus. Хоча в розпорядженні Л. Пастера не було методу чистих культур, але йому з учнями вдалося, користуючись елективних середовищами, довести потребу мікроорганізмів в головних і другорядних компонентах середовища і в джерелах енергії.
У 1870 році Р. Кох ввів в практичну мікробіологію метод чистих культур, які гарантували отримання на запропонованих ним щільних поживних середовищах чистих культур тільки певних видів бактерій.
Потреба в складних речовинах, необхідних для мікроорганізмів і іменованих в даний час «факторами зростання», вперше встановив Вільде в 1901 році. Він довів, що вітамін В є одним з факторів, необхідних для росту дріжджів. На перших етапах мікробіологічних дослідженні культивування мікроорганізмів здійснювали в пробірках або колбах шляхом вирощування їх на поверхні щільних або рідких середовищ. Для більш об'ємного промислового культивування мікроорганізмів з метою отримання з них різних біопрепаратів стали переходити на використання скляного посуду великої місткості (матраци, бутлі). Причому, в такому посуді вирощували мікроорганізми головним чином на щільних агарових середовищах. Новим етапом в культивуванні мікроорганізмів з'явився застосований в 1933 році Клюйвер і Пергін спосіб струшування колб з рідким середовищем на гойдалках з примусовою подачею стерильного повітря. На цій основі було розроблено так званий глибинний метод вирощування мікроорганізмів.
Промисловий біотехнологічний процес, в якому для виробництва комерційних продуктів використовують клітинні системи або мікроорганізми, зазвичай включає три ключові стадії:
- підготовчу (обробка сировини, використовуваного в якості джерела поживних речовин, і приготування. Якщо це необхідно, поживних середовищ);
- біотехнологічну (зростання мікроорганізмів-мішеней у великому - зазвичай обсягом понад 100 л - біореакторі (ферментація) з подальшим утворенням потрібного метаболіти, наприклад антибіотика, амінокислоти або білка (біотрансформація));
- отримання готової продукції (очищення цільового продукту від компонентів культурального середовища або від клітинної маси).
Ключовим напрямком біотехнології є інтенсифікація виробничих процесів. Цього можна досягти як шляхом використання нових високопродуктивних біооб'єктів, так і шляхом застосування ефективних технологічних режимів. Необхідно підібрати оптимальний субстрат, розробити конструкцію апарату, оптимізувати умови культивування біооб'єкту, забезпечити автоматичний контроль за перебігом процесу, розробити спосіб виділення та очищення готового цільового продукту.
Для культивування бактерій використовують поживні середовища, до яких пред'являється ряд вимог.
1. Поживність. Бактерії повинні містити всі необхідні поживні речовини.
2. Ізотонічність. Бактерії повинні містити набір солей для підтримки осмотичного тиску, певну концентрацію хлориду натрію.
3. Оптимальний рН (кислотність) середовища. Кислотність середовища забезпечує функціонування ферментів бактерій; для більшості бактерій становить 7,2-7,6.
4. Оптимальний електронний потенціал, який свідчить про вміст у середовищі розчиненого кисню. Він повинен бути високим для аеробів і низьким для анаеробів.
5. Прозорість (спостерігалося зростання бактерій, особливо для рідких середовищ).
6. Стерильність (відсутність інших бактерій).
Класифікація поживних середовищ
1. За походженням:
1) природні (молоко, желатин, картопля і ін.);
2) штучні - середовища, приготовані з спеціально підготовлених природних компонентів (пептона, аминопептид, дріжджового екстракту і т. П.);
3) синтетичні - середовища відомого складу, приготовлені з хімічно чистих неорганічних і органічних сполук (солей, амінокислот, вуглеводів і т. Д.).
1) прості - мясопептонний агар, мясопептонний бульйон, агар Хоттингера і ін .;
2) складні - це прості з додаванням додаткового живильного компонента (кров'яного, шоколадного агару): цукровий бульйон,
жовчний бульйон, сироватковий агар, желточно-сольовий агар, середа Китта-Тароцці, середа Вільсона-Блера і ін.
3. За консистенцією:
1) тверді (містять 3-5% агар-агар);
2) напіврідкі (0,15-0,7% агар-агар);
3) рідкі (не містять агар-агар).
Агар- полісахарид складного складу з морських водоростей, основний затверджувач для щільних (твердих) середовищ.
4. В залежності від призначення ПС розрізняють:
• середовища для підтримки культури
• накопичувальні (насичення, збагачення)
Диференційно-діагностичні - це складні середовища, на кото-яких мікроорганізми різних видів ростуть по-різному, в залежності від біохімічних властивостей культури. Вони призначені для иденти-ції видової приналежності мікроорганізмів, широко викорис-ся в клінічній бактеріології та проведенні генетичних ис-ліджень.
Селективні, інгібіторні і елективні ПС призначені для вирощування строго певного виду мікроорганізму. Ці середовища служать для виділення бактерій з змішаних популяцій і диффе-ренцірованія їх від подібних видів. До їх складу додають різні речовини, що пригнічують ріст одних видів і не впливають на зростання дру-гих.
Середу можна зробити селективної за рахунок величини рН. Останнім часом в якості речовин, що додають середах селективний характер, застосовують антимікробні агенти, такі як антибіотики і інші хіміотерапевтичні речовини.
Електівниє ПС знайшли широке застосування при виділенні возбу-ників кишкових інфекцій. При додаванні малахітовою або голив-ліантовой зелені, солей жовчних кислот (зокрема, таурохолевой-кислого натрію), значної кількості хлориду натрію або ли-моннокіслих солей пригнічується ріст кишкової палички, але зростання па-тогенних бактерій кишкової групи не погіршується. Деякі елек-тивні середовища готують з додаванням антибіотиків.
Середовища для підтримки культури складають так, щоб в них не було селективних речовин, здатних викликати мінливість куль-тур.
Накопичувальні ПС (збагачення, насичення) - це середовища, на кото-яких певні види культур або групи культур ростуть швидше й інтенсивніше супутніх. При культивуванні на цих середовищах зазвичай не застосовуються інгібіторні речовини, а, навпаки, створюють сприятливі умови для певного присутнього в суміші виду. Основою середовищ накопичення є жовч і її солі, тетратионат натрію, різні барвники, селенітовий солі, антибіотики та ін.
Консервуючі середовища служать для первинного посіву та транспор-вання досліджуваного матеріалу.
Виділяють також контрольні ПС, які застосовують для контро-ля стерильності і загальної бактеріального обсіменіння антібіоті-ков.
5. По набору поживних речовин виділяють:
• мінімальні середовища, які містять лише джерела живлення, достатні для зростання;
• багаті середовища, до складу яких входять багато додаткові речовини.
6. За масштабами використання ПС поділяються на:
> Виробничі (технологічні);
> Середовища для наукових досліджень з обмеженим за обсягом застосуванням.
Виробничі ПС повинні бути доступними, економічними, зручними в приготуванні і використанні для великомасштабного культивування. Середовища для наукових досліджень, як правило, б-вают синтетичними і багатими по набору поживних речовин.
Вибір сировинних джерел для конструювання поживних середовищ
Якість ПС багато в чому визначається повноцінністю складу пі-тательних субстратів і вихідної сировини, використовуваного для їх при-виготовлених. Велика розмаїтість видів сировинних джерел ставить складне завдання вибору найбільш перспективних, придатних для кон-струірованія ПС необхідної якості. Визначальну роль в даному питанні грають, перш за все, біохімічні показники складу си-рья, від яких залежить вибір способу і режимів його переробки з метою найбільш повного і ефективного використання містять-ся в ньому поживних речовин.
Для отримання ПС з особливо цінними властивостями застосовують насамперед традиційні джерела білка тваринного походження, а саме м'ясо великої рогатої худоби (ВРХ), казеїн, рибу і продукти її переробки. Найбільш повно розроблені і широко застосовуються ПС на основі м'яса ВРХ.
З огляду на дефіцит кільки каспійської, широко застосовується в не-далекому минулому, для отримання рибних поживних основ стала використовуватися більш дешева і доступна нехарчова продукція риб-ної промисловості - сухий криль, відходи переробки м'яса криля, філетірованний минтай і його перезрілу ікру. Найбільше ж рас-рення отримала рибна кормова мука (РКМ), задовольняю-щая вимогам біологічної цінності, доступності та щодо відповідності-ної стандартності.
Досить широкого поширення набули ПС на основі казеі-на, який містить всі компоненти, наявні в молоці: жир, лак-тозу, вітаміни, ферменти і солі. Однак необхідно відзначити, що в зв'язку з подорожчанням продуктів переробки молока, а також вище-ням попиту на казеїн на світовому ринку, застосування його носить не-скільки обмежений характер.
З нехарчових джерел білка тваринного походження в якост-стве сировини для конструювання повноцінних ПС необхідно виокрем-лити кров забійних тварин, яка багата біологічно активні-ми речовинами і мікроелементами і містить продукти клітинного і тканинного обміну.
Гідролізати крові сільськогосподарсь-ських тварин використовуються в якості замінників пептона в диференційно-діагностичних поживних середовищах.
До інших видів белоксодержащіх сировини тваринного происхожде-ня, які можуть бути використані для конструювання ПС, від-носяться: плацента і селезінка ВРХ, сухий білковий концентрат - про-дукт переробки м'ясних відходів, спилковий обріз, що отримується при обробці шкіри, ембріони домашніх птахів - відхід вакцинного вироб-ництва, кровозамінники з вичерпаним терміном придатності, сирна сироватка, м'які тканини молюсків і ластоногих.
Перспективно використання тушок хутрових звірів з зверохозяйств, крові ВРХ, одержуваної на м'ясокомбінаті, знежиреного молока і молочної сироватки (відходи маслозаводів).
З продуктів рослинного походження в якості білкового субстрату для ПС можливе використання кукурудзи, сої, гороху, кар-тофель, люпину та ін. Однак, рослинне сільськогосподарське си-рье містить білок, незбалансований склад якого залежить від умов вирощування культур, а також ліпіди в великих кількісних-вах, ніж продукти тваринного походження.
Розроблено цілий ряд ПС комбінованого складу з білкових субстратів різного походження. До них відносяться дріжджова казеїнова живильне середовище, дріжджова м'ясна і т.д. Основою більшості відомих ПС є гідролізат казеі-на, м'яса великої рогатої худоби та риби (до 80%).
Питома ж вага нехарчової сировини в технології конструювання ПС становить всього 15% і в далекій-шем вимагає збільшення.
Що використовується для отримання поживної основи (ПС) нехарчове сировина повинна відповідати певним вимогам, а саме бути:
^ Повноцінним (кількісний і якісний склад сировини повинен, в основному, задовольняти живильним потребам мікро-організмів і клітин, для яких розробляються ПС);
^ Доступним (мати досить велику сировинну базу);
^ Технологічним (витрати на впровадження у виробництво повинні здійснюватися з використанням наявного обладнання або су-суспільством технології);
^ Економічним (витрати на впровадження технології при переході на нову сировину і його переробку не повинні перевищувати норми за-трат для отримання цільового продукту);
^ Стандартним (мати тривалі терміни зберігання без зміни фізико-хімічних властивостей і поживної цінності)