Матеріал для дослідження: випорожнення, залишки харчових продуктів, блювотні маси, промивні води шлунка, сеча, гній, виділення вуха, ліквор, кров, секційний матеріал, змиви з об'єктів зовнішнього середовища.
Методи лабораторної діагностики:
1) Бактеріологічний - основний
Схема бактеріологічного дослідження матеріалу
- З матеріалу роблять мазок, фарбують за Грамом, микроскопируют і дають попередню відповідь.
- Матеріал з одного обстежуваного засівають на 6 чашок Петрі з середовищами: Ендо і Левіна - для виділення ЕПЕ; Плоскирева з антибіотиком і Плоскирева без антибіотика - виділення шигел; ВСА - для виділення сальмонел; СПА - для виділення иерсиний. Всі посіви інкубують при 37 ° С протягом 24 год, крім чашки з ВСА, яку інкубують протягом 48 год.
- Матеріал засівають в селенітовий бульйон → 37 о С 14-16 годину.
- З матеріалом проводять фагодіагностіку (з чумних, черевнотифозні, сальмонельозним, полівалентним шігеллёзним бактеріофагами), тобто прискорений метод ідентифікації, що дозволяє дати попередню відповідь, але не виключає проведення бактеріологічного дослідження.
1. На чашці Петрі з середовищем Ендо (Левіна) відбирають 10 ізольованих типових щодо ЕПЕ колоній.
2. 1/3 кожної колонії перевіряють на приналежність до E.coli за допомогою РА на склі з полівалентною ешеріхіозной ОКА-сироваткою.
3. Другу третину тієї ж колонії пересівають на одну із середовищ первинної ідентифікації: Кліглера або Ресселя або Олькеницкого з метою визначення родової приналежності культури → 37 о С 24 год.
4. Частину, що залишилася (третю) частину цієї ж колонії пересівають на скошений СПА з метою виділення та накопичення чистої культури і її серологічної ідентифікації → 37 о С.
1. Проводять первинну ідентифікацію культури (визначають її родову приналежність) за характером росту на середовищі Кліглера (Ресселя).
2. Перевіряють однорідність виділеної чистої культури, тобто роблять мазок зі скошеного СПА, фарбують за Грамом, микроскопируют, повинні бути клітини однорідні.
3. Роблять посів чистої культури на середовища Гіссен і СПБ з двома індикаторними папірцями (на індол і сірководень) → 37 о С 24 год.
4. Посів на середу Сіммонса → 37 о С 24 год.
5. Посів в стовпчик полужідкогоагара → 37 о С 24 год.
6. Проба на оксидазу.
Р. Перші 6 тестів ставляться до тестів мінімального диференціального ряду ентеробактерій.
7. Ставлять РА на склі з полівалентними ешеріхіозной ОКА, ОКВ, ОКС, ОКД, ОКЕ сироватками (підтверджують приналежність до роду і визначають кількість сироваток для визначення серовара ЕПЕ).
8. Ставлять РА на склі з живою культурою і ОК-імуноглобулінами для визначення К-антигену і РА на склі з Гретою культурою (при 100 ° С 30 хв на водяній бані) і груповими і факторними ОК-сироватками для визначення О-антигену ЕПЕ.
9. Якщо немає ОК-імуноглобулінів і групових і факторних О-сироваток, можна визначити серовар ЕПЕ шляхом постановки розгорнутої РА з живою і гріти культурами (при 100 ° С протягом 1 години) і груповими ОК-сироватками.
10. Проба на чутливість виділеного штаму до антибіотиків → 37 о С 24 год.
1. Облік результатів всіх тестів.
2. У рухливих штамів додатково визначають Н-антиген в РА на склі з ешеріхіозной Н-сироватками.
3. Виписують відповідь.
Висновок: «Виділено E.coli 020: До 84, чутливі до левоміцетину і канаміцину, проміжні до тетрацикліну, стійкі до пеніциліну і ампіциліну».
Для остаточної ідентифікації виділеної культури для
визначення серовара ЕПЕ ставлять розгорнуту РА з живою і гріти культурами і груповими ешеріхіозной ОК-сироватками.
- Роблять змив чистої культури ЕПЕ, вносячи в пробірку мл стерильного їхн. Частина змиву переносять в стерильну пробірку і прогрівають на водяній бані при 100 ° С протягом 1 години (убита культура), друга частина змиву - жива культура.
- У двох рядах серологічних пробірок роблять дворазові зростаючі розведення ОК-сироватки в стерильному їхн, починаючи з 1:50 до 0-титру, вказаного на етикетці, непрінімая до уваги титру К-антитіл. Реакцію ставлять в обсязі 1 мл. КС і КА ставлять за загальноприйнятою методикою.
- У всі пробірки 1 ряду вносять по 1 краплі суспензії живих бактерій в їхн, а II ряду - по 2 краплі Гретою культури, попередньо охолодженої.
- Облік результатів проводять через 18-20 годин інкубації при 37 ° С Нево-споруд оком (жива культура) і агглютіноскопе (прогріта культура). Для живої культури характерне утворення крупнохлопчатого К-агглютіната, для прогрітій - дрібнозернистого О-агглютіната.
Результат оцінюють як позитивний при одночасній наявності О-агглютіната до титру або половини титру К-антитіл, зазначеного на етикетці, а також О-агглютіната до титру або половини титру О-антитіл, зазначеного на етикетці; або О-аглютинації в обох рядах пробірок до титру або половини титру О-антитіл.
При виявленні агглютінінов в сироватках хворих використовується РНГА, за допомогою якої визначають Про - антитіла у хворих коліентеритів.
Для повної характеристики діарейнихешеріхій визначають також їх вірулентність: интраназально заражають мишей, визначають гемолітичні властивості.