Для приготування скошеного агару пробірки з 3-4 мл розплавленого мясопептонного агару залиште до повного за-стиванія в похилому положенні. Кут нахилу 25-30 ° досягається шляхом підкладання під пробірки рейки.
Для приготування чашок Петрі з агаром фламбіруйте над пальником шийку колби з розплавленим мясопептонний агаром і розлийте в стерильні чашки Петрі розплавлений агар. Товщина шару агару 0,5-0,7 см.
При пересівання культури на рідкі та щільні поживні середовища необхідно дотримуватися стерильність. У ліву руку візь-міте обидві пробірки (з ростом культури і живильним середовищем), помістіть їх на 2 пальця лівої руки в напівгоризонтального по-додатку і притримуйте їх великим пальцем так, щоб всі маніпуляції здійснювати під контролем очі. Прожарити петлю на полум'ї пальника перед взяттям культури. Потім трьома пальця-ми правої руки (як писальний перо) візьміть бактеріологічну петлю, а мізинцем над полум'ям вийміть пробки з пробірок.
1. При посіві культури на скошений агар пробірку з середовищем тримайте свої руки вільними скошеної поверхнею вгору. Простерилізованою і охолодженої петлею візьміть матеріал для по-сівби (в даному випадку культуру стафілокока) і обережно вве-дитя петлю в конденсаційну рідина скошеного агару. За-тим ковзаючим рухом по скошеної поверхні середовища нанесіть штрихи від однієї стінки пробірки до іншої знизу вгору; після посіву прокалите петлю.
2. Посів культури в агарових стовпчик (уколом) про-переводять в щільну середу (МПА) за допомогою бактерії-логічної петлі. Для цього прокаленной і охолодженої петлею торкаються до культури мікроба і вносять її в пробірку з живильним сере-дою. Посів роблять уколом в стовпчик середовища до дна пробірки.
3 При посіві культури бактерій в рідкі поживні середовища необхідно врахувати наступне: не допускати, щоб рідке середовище виливалася і змочувала пробку при напівгоризонтального положення пробірки.
Бактеріологічний метод дослідження
Це основний метод, який використовується при лабораторній ді-агностики інфекційних захворювань. Сутність бактеріологи-чеського методу дослідження - посів патологічного ма-ла від хворих і виділення чистої культури збудника з по-наступній ідентифікацією його за морфологічними. культуральним, тинкторіальними, біохімічними та антигенними приз-накам.
Метод виділення чистих культур, що дозволяє изолиро-вать окремі види мікробів з тієї чи іншої природного середовища їх проживання, є найважливішим методом Микробиол-ня дослідження. Першим, хто запропонував метод виділення чистої культури, був Л. Пастер.
Спосіб Пастера, заснований на застосуванні рідких пита-них середовищ, забезпечував виділення чистої культури переваж-громадської з матеріалу, що містить один вид мікроба (наприклад, з крові при септицемії і ін.). Він був менш ефек-тівен в тих випадках, коли необхідно було ізолювати від-слушні види мікроорганізмів з їх суміші. Тим часом, в есте-дарських умовах матеріал для бактеріологічного дослідження (мокрота, гній, грунт, вода та ін.) Найчастіше містить суміш різноманітних мікроорганізмів.
Успішне виділення бактеріальних сумішей і ізольований-ве вивчення окремих видів стало можливим завдяки усо-вдосконаленню методу виділення чистих культур Робертом Кохом (R. Косh), який застосував для цієї мети в 1881 році пліт-ні поживні середовища, на яких при посіві вдається розбраті-ділити матеріал таким чином, що окремі мікробні кліть-ки розташовуються ізольовано один від одного. При відпо-ціалу умовах (живильне середовище, оптимальна температу-ра) розмноження ізольованих клітин дає потомство одного і того ж виду, т. Е. Чисту культуру даного виду мікробів.
Через певний період (найчастіше через добу) на тих міс-тах щільного поживного середовища, на яких виявилися изолиро-ванні клітини, утворюються популяції розмножилися мікро-бов - так звані колонії, видимі неозброєним гла-зом. Вони не являють собою хаотичного скупчення мікро-бов, про що можна судити вже по тому, що для багатьох видів мік-Робово колонії мають характерну структуру, в силу чого можна орієнтовно визначити флору досліджуваного матеріалу і вибрати ті колонії, які підлягають подальшому вивченню. Пересівши таких колоній на відповідну живильне середовище і є виділення чистої культури.
Виділення чистих культур з подальшою їх ідентифік-цією має першорядне значення в діагностиці інфекційно-них захворювань, забезпечуючи швидке їх розпізнавання, своє-тимчасове лікування і профілактику. Воно не менш важливо у визначенні мікрофлори при дослідженні санітарно-гігієнічного стану об'єктів зовнішнього середовища (повітря, вода, грунт і т. Д.), А також при виконанні наукових досліджень.
В даний час є численні методи виокрем-лення чистих культур. Деякі з них використовуються ограни-ченно, інші знаходять широке застосування. Найбільш універ-сальним є викладені нижче методи виділення чистих культур бактерій (метод Дрігальского). У той час як інші мікроорганізми - спірохети, найпростіші - вимагають застосування спеціальних методів виділення або зовсім не можуть бути виділені на штучних поживних середовищах (деякі найпростіші, рикетсії, віруси).
Методи виділення чистих культур з мікробних сумішей прийнято ділити на дві основні групи: методи, засновані на принципі механічного роз'єднання мікробів в живильному середовищі, і методи, засновані на використанні біологічних властивостей мікробів. Перша група включає методи ізольовани-ня окремих клітин: 1) в глибині живильного середовища; 2) на поверхні середовища і 3) під контролем очі. У другій групі ис-товують такі властивості мікробів, як їх рухливість, відно-шення до температури, кисню і їх патогенні властивості.
Техніка посіву та пересіву
Посівом в мікробіологічній практиці називають внесен-ня в стерильну живильне середовище будь-якого досліджуваного матеріалу для виявлення мікроорганізмів.
Пересівши - це перенесення вирощених мікроорганізмів в стерильне середовище. Посіви і пересівання мікробів є одним з найбільш поширених прийомів у мікробіологічній практиці.
Пересівання виробляють так, щоб в живильне середовище не потрапили через повітря або з поверхні навколишніх предметів сторонні мікроорганізми. Для цього необхідно строго со-блюдать наступні прийоми:
1) посіви виробляють безпосередньо біля запаленої пальника, у полум'ї якої стерилізують петлі, Пінці-ти, ватяні пробки, краю пробірок;
2) в ліву руку беруть одну пробірку з пересівати куль-турою, іншу (зі стерильною живильним середовищем) дер-жать в похилому положенні між великим і указу-них пальцями;
3) петлю тримають у вертикальному положенні над полум'ям пальника і прожарюють її металеву частину докрасіть-на, а потім нахиляють горизонтально і стерилізують держатель петлі;
4) виймають ватні пробки і тримають їх безіменним пальцем і мізинцем правої руки; класти пробки на стіл або на який-небудь предмет не рекомендується;
5) обпалюють краю обох пробірок;
6) вносять петлю в пробірку з пересівати культурою обережно, не торкаючись стінок, захоплюють краплю жид-кістки або невелика кількість нальоту на твердому середовищі і переносять, намагаючись не зачепити стінок, в другу пробірку з обеспложенной живильним середовищем;
7) петлю виймають, обпалюють краю пробірок і внутрішні кінці пробок. Якщо ватяна пробка загориться, то нею за-кривают пробірку, а зовнішній кінець гасять рукою або пінцетом;
8) петлю знову обпалюють у полум'ї, на пробірці роблять відповідний напис: назва культури і дату по-сівби.
Посів в рідке середовище можна виробляти пастерівської або градуйованою піпеткою. При використанні пастерівської піпетки обпаленим пінцетом слід надломити запаяний кінець і злегка обпалити всю піпетку. Пробірку з досліджуваної культурою поміщають в ліву руку, а піпетку - в праву між великим і середнім пальцями, затиснувши її верхній отвір указу-них пальцем.
Вийнявши ватяну пробку з пробірки, обпалюють краю послід-ній. Обережно опускають піпетку в пробірку і знімають указу-них палець. Потім закривають вказівним пальцем верхній отвір піпетки, виймають її з пробірки. Ватяну пробку і краю пробірки, перед тим як закрити, обпалюють. Досліджуваний матеріал переносять в рідку середу. Після по-сівби піпетки поміщають у дезінфікуючий розчин.
Посів на щільні середовища. При посіві на косою агар завдають прямої або зигзагоподібний штрих. Для цього петлю з засідан ваемого матеріалом вводять в пробірку до скопилася на дні конденсаційної води і обережно, не розпушуючи агар, наносять штрих. Суцільний посів отримують при розмазування посівного матеріалу по всій поверхні косого агару.
На щільному середовищі в чашці Петрі посів роблять дотримуюся-щим чином. Живильне середовище в пробірках розплавляють на киплячій водяній бані, охолоджують до 48-50 ° С і розливають рів-ним шаром висотою 3-5 мм в стерильні чашки. Застиглу середу підсушують в термостаті в закритих чашках протягом 20-30 хвилин. Відкриті чашки кладуть догори дном на полиці тер-мостата, покриті стерильною папером. Поруч з чашками з-розміщують кришки. При підсушуванні з поверхні живильного середовища і внутрішньої поверхні чашок випаровується конденсації-ційна вода. Посів роблять петлею у вигляді паралельних штрихів або скляним шпателем.
При визначенні виду мікроба і для вирощування ана-еробов проводять посів уколом в стовпчик агару або желатину. Для цього пробірку перевертають догори дном і довгою прямий голкою з посівним матеріалом проколюють стовпчик середовища зверху вниз до самого дна. Потім голку обережно виймають і пробірку закривають обпаленої ватним корком. Якщо необхідні особливі запобіжні заходи проти інфікування, посіви ведуть в спеціальній шафі для пересіву чистих культур. Засіяні пробірки і чашки Петрі поміщають в термостат для вирощування.
Мікроорганізми і суперечки, що знаходяться всередині живильник-них середовищ або на їх поверхні, не можуть пересуватися, а осту-ються в тому місці, де вони перебували в момент застигання. Каж-дая клітина або спору починає розмножуватися і через 2-3 дня утворює колонію - величезна кількість клітин одного виду. Якщо колонія утворилася з однієї клітини, то це буде чиста культура того мікроорганізму, з клітки якого вона виросла.
Виросли колонії переглядають спочатку неозброєним оком, а потім за допомогою лупи або під мікроскопом. При цьому не можна не помітити, що колонії відрізняються по зовніш-нього вигляду, забарвленням, будовою і т. Д.
Вивчення бактеріальних колоній
Колонію, що виросла на агарі в чашці Петрі, вивчають сну-чала неозброєним оком в прохідному світлі. Відзначають про-щий характер росту і число колоній (мало, багато, несосчіти-ваемое кількість і т. Д.), Підкреслюючи при цьому спеціальним чорнилом або олівцем (з боку дна чашки) колонії, які відрізняються між собою.
Відзначають величину колонії (велика, дрібна, точкова), вимірюючи її окулярним мікрометрів і переводячи в міліметри: точкові колонії - менше 1 мм в діаметрі, видимі неозброєним оком; дрібні - в 1-2 мм, середні - в 2-4 мм, великі - в 4-6 мм і більше в діаметрі.
Колонія може мати правильну круглу форму; Ні-правильну - амебовидную, розеткообразную, різоідную або корневідним. Колонії можуть бути помітно піднятими над середовищем - опуклими або плоскими, плосковипуклой; Купол-образними з піднятою серединою або вдавлення в центрі. Відзначають характер поверхні: матова або блискуча, голод-кая або шорстка.
Колонії можуть бути з рівними краями; хвилястими (з неглибокими пологими вдавлениями), часточковими - глибоко через різаними, круглозубчатимі з невеликими неглибокими зуб-цями; ерозованих з нерівними гострими зубцями, торочкуватими з тонкими, часто вигнутими виростами; у вигляді «локонів».
Структуру колоній вивчають під лупою або мікроскопом зі слабким збільшенням, сухий системою при звуженої діафрагми або кілька спущеному конденсорі, при цьому чашку примі-ють на столик дном вгору і, пересуваючи її, відзначають колонії різної структури.
За кольором колонії можуть бути дуже різноманітними. Найчастіше вони зустрічаються абсолютно безбарвні, іноді білі, молочно-каламутні, блакитні, жовті, золотисті, золотисто-жовті, помаранчеві, лимонно-жовті, бузкові, червоні і чер-ні. Іноді в товщі колонії розвиваються невеликі освітньої-ня сферичної або неправильної форми (дочірні колонії). Вони відрізняються від основної колонії особливу здатність заломлювати світло. Механізм утворення дочірніх колоній не з'ясований, однак зазначено, що в міру їх зростання материнська ко-лонія лизируется.
Консистенцію колонії визначають при дотику до неї петлею.
Структура і форма колоній, так само як і інші ознаки, можуть змінюватися. Добре вивчені S - і R-форми. S-форми круглі, гладкі, опуклі, з рівними краями, мають блискучу поверхню. Шорсткі R-колонії неправильної форми, з зазубреними краями і шорсткою поверхнею.
Виділення чистої культури бактерій аеробів
Чистої культурою бактерій називають видимий зростання од-ного виду мікробів, отриманих з однієї клітини.
Виділення чистої культури є основою бактеріоло-ня роботи, так як в практичній діяльності лікаря-бактеріологу доводиться мати справу з матеріалом, що містить суміш мікробів (гній, випорожнення і т. П.). Ідентифікація виду можлива тільки тоді, коли бактерії отримані в чистому, кодованому вигляді.
Виділення чистої культури лежить в основі бактеріологи-чеського дослідження - найважливішого методу лабораторної ді-агностики інфекційних захворювань.
Мета - виділення культури і її ідентифікація, що позво-ляет правильно поставити діагноз інфекційного захворювання.
Основне завдання при виділенні чистої культури - напів-чення окремих колоній, т. Е. Скупчення мікробів одного виду як результату розмноження однієї клітини. Найпростішим способом роз'єднання бактерій є послідовне розтирання досліджуваного матеріалу скляним шпателем або бактеріальної піпеткою по поверхні мясопептонного агару в чашках Петрі.
Самостійна робота студента
на практичному занятті
Послідовність дій (етапи)