1.1. Характеристика штаму-продуцента лакказу.
Як продуцента ферменту лакказу використовують культуру вищих базидіальних гриба Trametes hirsuta 56 (Wulfen.) Pilát.
Штам-продуцент характеризується високою швидкістю росту і активним синтезом екстрацеллюлярной лакказу в умовах жидкофазного глибинного культивування.
На твердій сусло-агаризованому середовищі утворює колонії з добре розвиненим шерстистого-волокнистих повітряним міцелієм. Зональність колоній не виражена. На 3-ю добу вирощування при температурі 32 о С діаметр колонії стає дорівнює 6-7 см. Повітряний міцелій білого кольору. Край колонії гладкий, піднятий. Реверзум незмінений, потім побілілий. При старінні колонії з жовтуватим або кремуватим відтінком, утворюють зачатки плодових тіл у вигляді горбків 3-10 мм в діаметрі. Запах приємний грибний.
У глибинній культурі міцеліальні агломерати опушені сферичної або неправильної форми діаметром від 1 до 8 мм. У глибинній і поверхневої культури, як правило, не утворює хламідоспори, артроспори і Оїдії. Гіфи септірованние, розгалужені під прямим кутом. Гіфи можуть утворювати здуття і потовщення на кінцях. Гіфи трьох типів, в глибинній культурі переважно двох типів: тонкі (1,0-2,0 мкм) і товсті (2,5-5,0 мкм). Пряжки поодинокі, великі, крутовигнуті, частіше без просвіту, іноді медальйонні.
Аероб. Оптимальна температура вирощування (31 ± 1) ° С, оптимальне значення рН 4,0.
1.2. Приготування поживного середовища.
Живильне середовище, г / л:
Кукурудзяний екстракт розвести окремо (100 г / л) і простерилізувати окремо при 0,18 МПа протягом 40 хвилин.
Борошно розвести в окремій ємності в невеликій кількості холодної води, влити в киплячу воду при інтенсивному перемішуванні, витримати 10 хвилин, додати солі і стерильний кукурудзяний екстракт. Охолодити до 30 о С. Довести рН до 5,7 шляхом титрування 10% Н2 SO4 або 10% КОН.
Приготовану середу розливають по 150 мл у качалочние колби місткістю 750 мл і закривають пробками з паперовими ковпачками.
1.3. Стерилізація живильного середовища.
Приготовлені колби з живильним середовищем поміщають в автоклав, стерилізують при тиску 0,18 МПа протягом 40 хв, потім охолоджують до температури (31 ± 1) ° С і використовують протягом місяця. Зберігають при кімнатній температурі.
1.4. Засів і вирощування посівного матеріалу в колбах.
Всі роботи з пересівом культури і відбором проб проводять в боксі в стерильних умовах в зоні полум'я.
Отримання посівного матеріалу в колбах проводять в декілька етапів (пасажів):
- перший пасаж - пересівши культури з твердої живильним середовищем (косяка) проводять з розрахунку 1 косяк на 1 качалочную колбу шляхом перенесення культури разом з шматочком агаризованому середовища за допомогою прокаленного мікробіологічного гачка.
- наступні пасажі (другий, третій і т.д.) проводять з розрахунку 10% об'ємних посівного матеріалу з попереднього пасажу (на 150 см 3 живильного середовища 15 см 3 культуральної рідини попереднього пасажу) методом перенесення посівного матеріалу за допомогою стерильної піпетки Мора з розширеним кінцем або за допомогою стерильного циліндра.
Для засіву посівного інокулятора потрібно підготувати 0,44 л посівного матеріалу третього і наступних пасажів. Термін зберігання посівного матеріалу 10 днів. Зберігають посівний матеріал в холодильнику при температурі +4 о С.
Засіяну колбу закривають стерильною ватною пробкою, поміщають на гойдалку в термостатіруемого кімнату і вирощують в наступному режимі:
- температура 30-32 о С
- частота обертання качалки 200 об / хв (180-240 об / хв)
- час вирощування: перший пасаж - 3-4 діб (72-96 год.)
другий - 2-3 доби. (48-72 год.)
третій і наступні - 2-3 доби. (48-72 год.)
Посівний матеріал контролюється (з розрахунку 10% посівних колб):
- на відсутність сторонньої мікрофлори шляхом висіву на м'ясо-пептони агар;
- на оксидазную активність спектрофотометрически;
- по морфолого-фізіологічними показниками шляхом микроскопирования вирощеного посівного матеріалу (згідно п. 1.1.).
Як виробничого посівного матеріалу використовується культуральная суспензія після 3-го і наступних пасажів (до 10).
Підтримка культури на твердому живильному середовищі і вирощування в колбах проводять згідно з інструкцією.
Готовий посівний матеріал в колбах використовується для засіву середовища в інокуляторе (поз. ФО-10) на стадії ТП-2.
Некондиційний посівний матеріал направляється на стадію ОБО-1.