Виділення ДНК з крові,

  1. отримати кров з вени добровольця;
  2. додати 0.5M EDTA до 50mM => 1 / 10V;
  3. змішати:

препарат крові з EDTA => 1V,
буфер 1 => 6V;

  • 0 o С, 1-4h;
  • ЦФ 1.5krpm, 4 o С, 15 ';
  • видалити супернатант;
  • осад ядер суспендувати в "буфер 2" в обсязі, рівному 0.8V взятого препарату крові;
  • додати

    proteinase K до 50μg / ml,
    SDS 10% до 1%, => 1 / 10V;

  • 37 o С, ON;
  • додати 3.0M AcONa pH7.5 до 0.3М => 1 / 10V;
  • м'яко екстрагувати нейтральним Ф, Ф: Х, Х (ЦФ 5krpm, NT, 10 ');
  • осадити NaCl / EtOH;
  • промити 70% EtOH;
  • розчинити осад в H2 O.
  • EDTA запобігає згортання крові. У деяких методах для цього використовують гепарин, але він є потужним інгібітором PCR і благополучно проходить крізь всю процедуру очищення.
  • Triton X-100 лизирует клітинну мембрану, але не руйнує ядро. На цьому етапі розкриваються кров'яні клітини, від лейкоцитів залишаються тільки ядра.
  • Осадження ядер лейкоцитів.
  • Отримання суспензії ядер.
  • Розщеплення білків Prot.K.
  • Напевно забобон, я зазвичай залишаю на ніч при 37 o С, а на пару годин - при 50 o С.
  • Після інкубації на 37 o С можна перерватися на 1-2 дня (зберігати при +4 o С).
  • Сіль краще додати до фенольной екстракції, тому що екстракція фенолом в низькосольову буфері може бути пов'язана зі значними втратами DNA.
    • Дивись також:
    / Посилання на мережеві ресурси /
    • Метод виділення ДНК для ПЛР з сухих плям крові обговорювалося на форумі. Працює дуже швидко, досить прокип'ятити зразок у воді зі смолою Chelex-100 і відібрати супернатант. Використовується в криміналістиці.

    на сьогоднішній день основне завдання - виділення тотальної ДНК з органів мишей (селезінка, гол мозок, кров, шкіра, сечовий міхур) для детекції ДНК збудника в ПЛР. збудник - бактерія (яка не має клітинної стінки) з внутрішньо-і позаклітинної локалізацією.

    питання:
    1. чи є сенс використовувати Гітц або все-таки протеїнази досить (до цього працювали тільки з протеіназойК)?
    2. від моменту взяття органу до моменту глибокої заморозки (-70) проходить до 5 годин. чи є сенс у використанні фіксуючих або лізуючого розчинів? спирт, ацетон, той же Гітц?
    3. з кров'ю мені все ясно, а от для органів, особливо з досить жорстким сполучнотканинних каркасом (сечовий міхур) чи достатня звичайна концентрація протеїнази, або варто спробувати збільшити її?
    4. в протоколах як присутній, так і відсутній етап екстракції сумішшю фенол-хлороформ (1: 1). робили і так, і так. х.з. та й не визначився - чи потрібен він? які теоретичні передумови має цей етап?
    5. в деяких протоколах використовують просто хлороформ, в інших хлороформ-ізоаміловийспірт (24: 1). чи є особливий сенс в цій суміші?
    6. свіжокуплений хлороформ кваліфікації хч пергонять не потрібно, я думаю?
    7. ось ще давно мучить питання - в лізуючого розчинах використовують гуанидин изотиоцианат, а чому хлорид не можна? у мене ось велика банка гуанидин хлориду варто. може не варто гроші витрачати?

    1. Я б поставив питання навпаки. З гуанідином-то швидше
    2. Гітц, а якщо просто детекция збудника, то киньте орган в холодильник
    3. ддостаточно звичайної концетрации, можна збільшити час
    4. Якщо використовуєте протеїназу, то відмивання фенолхлороформом обов'язкове, і взагалі в будь-якому випадку вона бажана
    5. я різниці не бачив
    6. краще використовувати "для молеулярной біології"
    7. изотиоцианат краще лизирует, а в іншому - пофігу

    Ізоаміловий спирт додають в хлороформ, щоб суміш не пінилась - тільки й усього.

    Схожі статті