бактеріофаги
За допомогою плазмідних векторів можна клонувати фрагменти ДНК завдовжки до 10 т. П. Н. Однак при створенні геномних бібліотек часто доводиться працювати з більшими фрагментами. Для цього були розроблені вектори на основі бактеріофага л Е. соli.
Після проникнення в клітину події можуть розвиватися за двома сценаріями. Якщо реалізується литический цикл, то фаг починає інтенсивно розмножуватися і приблизно через 20 хв клітина руйнується (лизирует) з вивільненням до 100 нових фагових частинок. При альтернативному варіанті розвитку подій фагів ДНК включається в хромосому Е. coli як профаг і реплицируется в клітці разом з нормальними бактеріальними генами (стан лизогении).
Однак при нестачі поживних речовин або інших несприятливих обставин інтегрована фагів ДНК вивільняється, і запускається литический цикл розвитку. Розмір ДНК фага л становить приблизно 50т. п. н. причому значна її частина (близько 20 т. і. н.) несуттєва для розмноження фага і відповідає за його вбудовування в хазяйську ДНК. У зв'язку з цим виникла ідея, що її можна замінити фрагментом іншої ДНК еквівалентного розміру. Утвориться рекомбінантна молекула буде реплицироваться в клітці як ДНК «рекомбінантного» фага л, «встав» на литический шлях розвитку.
Щоб зрозуміти, як функціонує векторна система на основі фага л, необхідно розглянути молекулярні аспекти литического циклу розвитку. Інфекційна фагів частка має головку, в якій міститься щільно упакована ДНК довжиною приблизно 50 т. П. Н. і відросток та відходять від нього тонкими білковими нитками (фибриллами). Збірка головки відростка і упаковка ДНК чітко скоординовані. ДНК фага л - це лінійна двох цепочечная молекула довжиною 50 т. П. Н. з одноланцюжковий 5 '- «хвостами» з 12 нуклеотидів. Їх називають липкими (cos) кінцями, оскільки вони взаємно комплементарні і можуть злучатися один з одним. Після того як фагів ДНК проходить через відросток і потрапляє в Е. coli, cos-кінці з'єднуються з утворенням кільцевої молекули. На ранньому етапі литического циклу в результаті реплікації кільцевої молекули ДНК утворюється лінійна молекула, що складається з декількох сегментів довжиною 50 т. П. Н.
Кожен з таких сегментів упаковується в білкову головку, до останньої приєднується вже зібраний відросток і утворюється нова фагів частка. При упаковці молекули ДНК завдовжки менше 38 т. П. Н. виходить неинфекционная фагів частка, а фрагменти довжиною понад 52 т. п. н. не поміщаються в головку. Сегменти довжиною 50 т. П. Н. в лінійній молекулі ДНК розділені cos-сайтами, і саме по цих сайтів розрізається молекула, коли черговий сегмент заповнює головку. Розрізання здійснює фермент, що знаходиться біля входу в головку.
В результаті досліджень по вивченню збірки фага л була розроблена система упаковки молекул ДНК in vitro з утворенням інфекційних фагових частинок. Змішавши в пробірці очищені порожні головки, фагів ДНК і зібрані відростки, можна отримати інфекційні фагів частинки.
Завдання дослідника полягає втому, щоб замінити цей центральний ділянку нуклеотидної послідовністю довжиною приблизно 20 т. П. Н. потрібної ДНК. ДНК, призначену для клонування, теж розщеплюють на фрагменти розміром від 15 до21 т. П. Н. Обидва препарати - фагів і чужорідну ДНК - об'єднують і додають ДНК - лігази. Фрагменти ДНК довжиною 50 т. П. Н. упаковуються в головки, до них приєднуються відростки і утворюються інфекційні фагів частинки. Фрагменти більшого (> 52 т. Л. Н.) Або меншого (<38 т. п. н.) размера упаковываться не могут.
Гібрид плазміди і фага. По суті справи, це просто плазмида, в яку додані сайти для зв'язування з білками оболонки фага (вони називаються cos-сайтами, і саме завдяки їм косміди отримали свою назву). Білкова оболонка робить косміди стабільніше, завдяки чому в неї можна завантажувати довші вставки.
Вектори, звані косміди, можуть включати до 40 т. П. Н. чужорідної ДНК і при цьому активно аміліфіпіціроваться в Е. coli як плазміди. Косміди об'єднують в собі властивості плазмідних векторів і векторів на основі фага л. Наприклад, широко застосовувана косміди pLFR-5 (приблизно 6 т. П. Н.) Має два cos-сайту фага л, розділених сайтом рестрикції, полілінкера з шістьма унікальними сайтами рестрикції, точку початку реплікації ДНК (ori) і ген стійкості до тетрацикліну ( Тс). Ця косміди може інтегрувати чужорідну ДНК довжиною до 40 т. П. Н. Препарати ДНК змішують і лигируют. Ті продукти легування, які містять вставку довжиною 40 т. П. Н. мають сумарний розмір, близький до 50 т. п. н. і, отже, можуть пакуватися in vitro в головки фага л. Реассоцііровавшіе молекули pLFR-5, що не містять вставок, упаковані не будуть. Після складання фагових частинок інфікують ними Е. coli.
Опинившись в бактеріальної клітці, лінійна молекула зі вставкою замикається в кільце завдяки парування cos-сайтів. У такій стабільній конфігурації вона може довгий час існувати в клітці і реплицироваться як гібридна плазміда, оскільки містить всі необхідні для цього елементи. Крім того, ген стійкості до тетрацикліну забезпечує зростання колоній, які несуть цю косміди. Косміди мають велику перевагу в порівнянні з плазмідами: в них можна вбудовувати більш протяжні фрагменти, а це означає, що для створення геномної бібліотеки потрібно менше число клонів і буде потрібно менше часу на їх скринінг.