Одні з найстрашніших захворювань, якими «обдаровує» людини природа, - це захворювання генетичні. Можна успішно боротися зі збудниками хвороб - бактеріями і вірусами, але, якщо проблема знаходиться в геномі людини від народження, допомогти пацієнтові вкрай важко. Сучасна наука наполегливо шукає можливість «відремонтувати» мутував гени.
Миодистрофия Дюшенна - одне з нечасто зустрічаються, але все ж відносно поширених генетичних захворювань. Хвороба діагностується в трьох-п'ятирічному віці, зазвичай у хлопчиків, проявляючись спочатку лише в ускладнених рухах, до десяти років страждає такий миодистрофией вже не може ходити, до 20-22 років його життя закінчується. Вона викликана мутацією гена дистрофина, який знаходиться в Х-хромосомі. Він кодує білок, що з'єднує мембрану м'язової клітини з скоротливі волокнами. Функціонально це своєрідна пружина, що забезпечує плавне скорочення і цілісність клітинної мембрани. Мутації в гені призводять до дистрофії скелетних м'язових тканин, діафрагми і серця. Лікування захворювання носить паліативний характер і дозволяє лише трохи полегшити страждання. Однак з розвитком генної інженерії з'явилося світло в кінці тунелю.
Генна терапія - це доставка всередину клітини конструкцій на основі нуклеїнових кислот для лікування генетичних захворювань. За допомогою такої терапії можна виправити генетичну проблему на рівні ДНК і РНК, змінюючи процес експресії потрібного білка. Наприклад, в клітку можна доставити ДНК з виправленою послідовністю, з якою синтезується функціональний білок. Або, навпаки, можливі видалення певних генетичних послідовностей, що також допоможе зменшити шкідливі наслідки мутації. У теорії це просто, однак на практиці генна терапія базується на найскладніших технологіях роботи з об'єктами мікросвіту і являє собою сукупність передових ноу-хау в галузі молекулярної біології.
«Ген дистрофина, мутації якого породжують Міодистрофія Дюшенна, величезний, - розповідає директор з розвитку біотехнологічної компанії« Марлін Біотех », кандидат біологічних наук Вадим Жорнівка. - Він включає в себе 2,5 млн пар нуклеотидів, що можна було б порівняти з кількістю букв в романі «Війна і мир». І от уявімо собі, що ми вирвали з епопеї кілька якихось важливих сторінок. Якщо на цих сторінках описуються суттєві події, то розуміння книги було б вже утруднено. Але з геном все складніше. Знайти іншу копію «Війни і миру» нескладно, і тоді відсутні сторінки можна було б прочитати. Але ген дистрофина знаходиться в X-хромосомі, а у чоловіків вона одна. Таким чином, в статевих хромосомах у хлопчиків при народженні зберігається лише одна копія гена. Іншу взяти ніде.
Нарешті, при синтезі білка з РНК важливо збереження рамки зчитування. Рамка зчитування визначає, яка група з трьох нуклеотидів зчитується як кодон, що відповідає одній амінокислоті в білку. Якщо відбулося видалення в гені фрагмента ДНК, що не кратне трьом нуклеотидам, відбувається зрушення рамки зчитування - кодування змінюється. Це можна було б порівняти з ситуацією, коли після вирваних сторінок в усій залишилася книзі всі букви заміняться на наступні за алфавітом. Вийде абракадабра. Ось те ж саме відбувається з неправильно синтезуються білком ».
Один з ефективних методів генної терапії для відновлення нормального синтезу білка - пропуск екзонів за допомогою коротких нуклеотидних послідовностей. У «Марлін Біотех» вже відпрацьована технологія роботи з геном дистрофина за допомогою такого методу. Як відомо, в процесі транскрипції (синтезу РНК) спочатку формується так звана прематрічная РНК, що містить у собі як кодують білок ділянки (екзонів), так і не кодують (інтрони). Далі починається процес сплайсингу, в ході якого інтрони і Екзони роз'єднуються і формується «зріла» РНК, що складається тільки з екзонів. У цей момент деякі екзонів можна заблокувати, «заліпити» за допомогою особливих молекул. У підсумку в зрілої РНК не виявиться тих кодують ділянок, від яких ми вважали за краще б позбутися, і таким чином відновиться рамка зчитування, білок буде синтезуватися.
«Цю технологію ми налагодили in vitro, - розповідає Вадим Жорнівка, тобто на клітинних культурах, вирощених з клітин пацієнтів з миодистрофией Дюшенна. Але окремі клітини - це не організм. Вторгаючись в процеси клітини, ми повинні спостерігати наслідки вживу, проте залучити до випробувань людей не представляється можливим з різних причин - від етичних до організаційних. Тому виникла необхідність отримання моделі міодистрофії Дюшенна з певними мутаціями на основі лабораторних тварин ».
Як вколоти мікросвіт
Трансгенні тварини - це отримані в лабораторії тварини, в геном яких цілеспрямовано, усвідомлено внесені зміни. Ще в 70-і роки минулого століття стало зрозуміло, що створення трансгенів - це найважливіший метод дослідження функцій генів і білків. Одним з найбільш ранніх методів отримання повністю генно-модифікованого організму стала ін'єкція ДНК в пронуклеус ( «попередник ядра») зигот запліднених яйцеклітин. Це логічно, тому що модифікувати геном тваринного найпростіше на самому початку його розвитку.
Ін'єкція в ядро зиготи - вельми нетривіальна процедура, адже мова йде про микромасштабах. Яйцеклітина миші має діаметр 100 мкм, а пронуклеус - 20 мкм. Операція відбувається під мікроскопом з 400-кратним збільшенням, однак ін'єкція - це сама що ні на є ручна робота. Зрозуміло, для «уколу» застосовується не традиційний шприц, а спеціальна скляна голка з порожнистим каналом всередині, куди набирається генний матеріал. Один її кінець можна тримати в руці, а інший - надтонкий і гострий - практично не видно неозброєним оком. Звичайно, така тендітна конструкція з боросилікатного скла не може зберігатися довго, тому в розпорядженні лабораторії є набір заготовок, які безпосередньо перед роботою витягуються на спеціальному верстаті. Використовується особлива система контрастної візуалізації клітини без фарбування - втручання в пронуклеус саме по собі травматично і є фактором ризику для виживання клітини. Фарба стала б ще одним таким чинником. На щастя, яйцеклітини досить живучі, проте кількість зигот, які дають початок трансгенним тваринам, складають лише кілька відсотків від загального числа яйцеклітин, в які була зроблена ін'єкція ДНК.
Наступний етап - хірургічний. Проводиться операція з трансплантації мікроін'ецірованних зигот в воронку яйцепроводу миші-реципієнта, яка стане сурогатною матір'ю майбутнім трансгенів. Далі лабораторне тварина природним шляхом проходить цикл вагітності, і на світ з'являється потомство. Зазвичай в посліді знаходиться близько 20% трансгенних мишей, що також говорить про недосконалість методу, бо в ньому є великий елемент випадковості. При ін'єкції дослідник не може контролювати, як саме впроваджені фрагменти ДНК вбудуються в геном майбутнього організму. Висока ймовірність таких комбінацій, які приведуть до загибелі тварини ще на ембріональній стадії. Проте метод працює і цілком придатний для ряду наукових цілей.
Ножиці для ДНК
Але є більш ефективний спосіб на основі цільового редагування генома за технологією CRISPR / Cas9. «Сьогодні молекулярна біологія в чомусь подібна епосі далеких морських експедицій під вітрилами, - говорить Вадим Жорнівка. - Практично щороку в цій науці відбуваються значні відкриття, які можуть змінити наше життя. Наприклад, кілька років тому мікробіологи виявили у давно, здавалося б, вивченого виду бактерій імунітет до вірусних інфекцій. В результаті подальших досліджень з'ясувалося, що ДНК бактерій містять в собі особливі локуси (CRISPR), з яких синтезуються фрагменти РНК, які вміють комплементарно зв'язуватися з нуклеїновими кислотами чужорідних елементів, наприклад з ДНК або РНК вірусів. З такою РНК зв'язується білок Cas9, що представляє собою фермент-нуклеазу. РНК служить для Cas9 гідом, позначати певну ділянку ДНК, в якому нуклеаза робить розріз. Приблизно три-п'ять років тому з'явилися перші наукові праці, в яких розроблялася технологія CRISPR / Cas9 для редагування генома ».
У порівнянні зі способом введення конструкції для випадкового вбудовування, новий метод дозволяє підібрати елементи системи CRISPR / Cas9 таким чином, щоб точно націлити РНК-гіди на потрібні ділянки геному і домогтися цілеспрямованої делеции або вставки потрібної послідовності ДНК. У цьому методі теж можливі помилки (РНК-гід іноді з'єднується ні з тією ділянкою, на який його націлюють), однак при використанні CRISPR / Cas9 ефективність створення трансгенів становить уже близько 80%. «Цей метод має широкі перспективи, і не тільки для створення трансгенів, а й в інших областях, зокрема в генній терапії, - каже Вадим Жорнівка. - Однак технологія знаходиться тільки на початку шляху, і уявити собі, що найближчим часом виправляти генний код людей будуть за допомогою CRISPR / Cas9, досить складно. Поки є ймовірність помилки, є і небезпека, що людина втратить якоїсь важливої кодує частини генома ».
Російської компанії «Марлін Біотех» вдалося створити трансгенну миша, в якій повністю відтворена мутація, яка призводить до міодистрофії Дюшенна, і наступним етапом стануть випробування технологій генної терапії. Разом з тим створення моделей генетичних захворювань людини на основі лабораторних тварин - не єдине можливе застосування трансгенів. Так, в Росії і західних лабораторіях ведуться роботи в області біотехнологій, що дозволяють отримувати важливі для фарміндустрії лікарські білки тваринного походження. Як продуцентів можуть виступати корови або кози, у яких можна змінювати клітинний апарат виробництва містяться в молоці білків. З молока можна екстрагувати лікарський білок, який отримано не хімічним способом, а за допомогою природного механізму, що підвищить ефективність ліків. В даний час розроблені технології отримання таких лікарських білків, як лактоферрин людини, проурокиназа, лізоцим, Атріна, антитромбін та інші.