Основним методом виділення чистих культур мікроорганізмів є метод, запропонований Р. Кохом. Принцип його полягає в отриманні чистої культури з окремої колонії. Однак цей метод непридатний для виділення мікроорганізмів, які не ростуть або погано ростуть на щільних середовищах. До числа таких мікроорганізмів відносяться деякі бактерії, багато водорості і найпростіші.
Мал. 6.2. Розсівання культури мікроорганізмів
на поверхню щільного середовища шпателем:
а - шпатель Дрігальского; б - розсівання; в - зростання
мікроорганізмів після розсівання
При виділенні чистої культури аеробних мікроорганізмів накопичувач-ву культуру висівають на поверхню щільного середовища. Порядок роботи сліду-ющий. Розплавлену на киплячій водяній бані стерильну і охолоджену до 50 ° С живильне середовище, що містить агар або желатину, розливають в сте-рільним чашки Петрі. Після того як середовище застигне, на її поверхню з піпетки наносять краплю накопичувальної культури або її розведення в стерильний-ної воді і стерильним скляним шпателем Дрігальского розподіляють краплю по поверхні щільного середовища в чашці Петрі. Далі цим же шпателем протирають поверхню середовища послідовно в другій, третій і четвертій чашках. Зазвичай в перших двох чашках після інкубації спостерігається суцільно-ної зростання мікроорганізмів, тоді як в наступних - зростання ізольованих колоній (рис. 6.2). Розсівати накопичувальну культуру можна бактеріологіч-ської петлею методом виснажує штриха. В цьому випадку накопичувальну куль-туру або її розведення відбирають петлею і на поверхні щільного середовища про-водять штрихи в порядку, зазначеному на рис. 6.3. Перед кожним новим штрихом петлю стерилізують в полум'ї пальника.
Після посіву чашки Петрі поміщають в термостат кришками вниз, щоб конденсаційна вода, що утворилася на кришці чашки при застиганні агару, не завадила отримати ізольовані колонії. Чашки витримують в термостаті протягом 1 -7 діб в залежності від швидкості росту мікроорга-низмов. Виросли ізольовані колонії відсівати петлею на поверхню скошеної щільною середовища в пробірці або в рідку середу.
Метод глибинного посіву. Ізольовані колонії мікроаерофільних мік-роорганізмов і факультативних анаеробів частіше отримують методом глибинного посіву. Для цього щільну живильне середовище попередньо розливають в пробірки по 15 -20 мл і стерилізують. Безпосередньо перед посівом про-бирки поміщають в киплячу водяну баню, щоб середовище розплавилася. Висів проводять з розведень накопичувальної культури в стерильній водопровідній воді. Розведення готують з таким розрахунком, щоб при висіві 0,5 - 1,0 мл раз-ведення отримати ізольовані колонії. Ступінь розведення визначається
щільністю накопичувальної культури. Висіву роблять, як правило, з трьох
чотирьох останніх розведень. Для це-го в пробірку з розплавленої і охолодженої до 48 - 50 ° С середовищем вносять 0,5-1,0 мл одного з розведень на-копітельной культури. посівний ма
теріал ретельно перемішують, обертаючи пробірку між долонями.
Мал. 6.3. Схема послідовності (7 - 5)
розсівання культури мікроорганізмів на поверхню щільного середовища петлею
Потім близько полум'я пальника виймають з пробірки пробку, випалюючи краю пробірки в полум'ї пальника, і швидко виливають вміст пробірки в стерильну чашку Петрі. Після того як щільних середу застигне, чашки Петрі поміщають в термостат. Колонії виросли в товщі середовища, вирізають стерильним скальпелем, витягають стерильними капілярними трубками або просто петлею і переносять в рідку середу, сприятливу для розвитку виділяються мікроорганізмів.
Особливі труднощі виникають при виділенні чистих культур облігатних анаеробів. Якщо контакт з молекулярним киснем не викликає відразу загибелі клітин, то посів проводять на поверхню середовища в чашки Петрі, але після посіву чашки негайно поміщають в анаеростатах. Однак частіше користуються методом розведення. Сутність його полягає в тому, що розведення накопичити-котельної культури проводять в розплавленої та охолодженої до 45 - 50 ° С агаризованому живильному середовищі. Роблять 6-10 послідовних розведень. Потім середу в пробірках швидко охолоджують і заливають поверхню шаром сте-рільним суміші парафіну і вазелінового масла (в співвідношенні 3: 1), що пре-перешкоджає проникненню повітря в товщу агаризованому середовища.
Іноді щільних живильне середовище після посіву і ретельного перемішування-вання переносять в стерильні трубки Бурри. Можна використовувати капілярні пі-Петки Пастера, в які набирають відповідне розведення накопичувальної куль-тури в розплавленої агаризованому живильному середовищі. Кінець капіляра запаюють. При вдало вибраному розведенні накопичувальної культури в одній з пробірок (пі-петок Пастера, трубок Бурри) виростають ізольовані колонії. Щоб витягти об-утворених колонії, надходять у такий спосіб. Видаляють стерильною голкою шар парафіну, а стовпчик агаризованому середовища обережно видувають з пробірки в стерильну чашку Петрі, пропускаючи газ, який не містить кисень, через капіляр або голку, поміщені між стінкою пробірки і агаризованому середовищем. Щільних-ву середу з трубки Бурри видувають, пропускаючи газ через ватяну пробку.
У деяких випадках щільну середу з пробірки витягують інакше. Пробірку злегка нагрівають, весь час швидко обертаючи її над полум'ям пальника. При цьому агар, непо-безпосередніх прилеглий до стінки, плавиться і вміст пробірки у вигляді агарові-го стовпчика легко вислизає в стерильну чашку Петрі. Стовпчик агару розрізають стерильним ланцетом і витягають колонії, захоплюючи їх стерильними капілярного-ми трубками або петлею. Можна також вирізати їх стерильним ланцетом. Витягнуті колонії переносять в рідку середу, сприятливу для розвитку виділяються мікро-організмів. Якщо ізольовані колонії отримані в капілярі, то після тщатель-ної дезінфекції поверхні його розламують стерильним пінцетом і ділянки ка-пілляра, що містять ізольовані колонії, переносять в стерильну середу.
Для отримання ізольованих колоній методом глибинного посіву і методом розведень рекомендується використовувати прояснені поживні середовища.
Метод обертових пробірок. Коли хочуть отримати ізольовані колонії облігатних анаеробних бактерій, що характеризуються особливо високою чутливістю до кисню (екстремальні анаероби), використовують метод обертових пробірок Р. Хангейта. Сутність його полягає в наступному. Розплавлену щільних середу засівають бактеріями при постійному струмі через пробірку стерильного інертного газу, звільненого від домішки кисню. Потім пробірку закривають гумовою пробкою і поміщають горизонтально в затиск, що обертає пробірку. Щільних середовище за цьому рівномірно розподіляється по стінках пробірки і застигає тонким шаром. Тонкий шар агаризованому середовища в пробірці, заповненої газовою сумішшю, дозволяє отримати ізольовані колонії, що абсолютно очевидно невооружен-ним оком (див. Рис. 6.4). Застосовують також модифікацію методу Р. Хангейта. При цьому розплавлену щільних середу при постійному струмі стерильного інертно-го газу розливають по пробірках. Потім пробірку закривають гумовою пробкою і по-розміщують горизонтально в затиск, що обертає пробірку. Після того як середовище на стін-ках пробірки застигне, виробляють засів середовища в цій пробірці в струмі стерильного газу за допомогою бактеріальної петлі, проводячи штрих під обертається пробірці в напрямку від її дна до шийки (рис. 6.5). Іноді для отримання чистої культури буває досить одного посіву в щільну середу, однак частіше посів в щільну живильне середовище повторюють 2-3 рази. Як посівного матеріалу при цьому використовують культуру, по-отриману з окремої колонії.